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 　　由于腫瘤是復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，3D腫瘤球體模型成為模擬腫瘤血管生成或轉(zhuǎn)移等生理學(xué)相關(guān)腫瘤微環(huán)境的相關(guān)模型系統(tǒng)。本實驗方案詳細(xì)闡述了使用 µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片(貨號：80376)將腫瘤球狀體包埋在I型膠原凝膠與內(nèi)皮細(xì)胞（人臍靜脈細(xì)胞，HUVECs）中進(jìn)行共培養(yǎng)。該模型還可以通過灌流培養(yǎng)技術(shù)來模擬體內(nèi)生理條件。

　　

　　ibidi為球狀體和類器官灌注培養(yǎng)提供多種解決方案：

　　

　　• µ-Slide III 3D Perfusion 

　　

　　• µ-Slide Spheroid Perfusion 

　　

　　• µ-Slide I Luer 3D 

　　

　　• µ-Slide With Multi-Cell µ-Pattern ibiTreat 

　　

　　• ibidi Collagen Type I 

　　

　　• ibidi Pump Systems and Accessories

　　

　　

　　相關(guān)文件:

　　

　　• Application Note 13: Endothelial Cells Under Perfusion 

　　

　　• Application Note 16 Immunofluorescence Staining Using the µ-Slide 8 Well high 

　　

　　• Application Guide 34: Cell Culture Under Flow 

　　

　　關(guān)鍵詞：3D培養(yǎng)模型、腫瘤微環(huán)境、3D共培養(yǎng)；內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤球狀體、腫瘤血管生成

　　

　　1、實驗材料

　　

　　注意：本方案針對Hep-G2腫瘤細(xì)胞球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化；使用其他細(xì)胞球狀體或內(nèi)皮細(xì)胞時，請調(diào)整試劑和緩沖液。

　　

　　1.1 試劑和緩沖液

　　

　　·人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，12203，Promocell 公司）

　　

　　·腫瘤細(xì)胞球狀體（如 Hep-G2 Leibniz-Institut DSMZ, ACC 180）

　　

　　·內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（Promocell，C-22010）

　　

　　·內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基 2（Promocell，C-22011）

　　

　　·PBS (14190144, Gibco)

　　

　　·Accutase細(xì)胞解離液（A1110501，Gibco）

　　

　　·I型膠原蛋白 、大鼠尾部（ibidi，50201）或牛（ibidi，50301），非胃蛋白酶化，5 mg/ml在17.5 mM或0.1M 酸中稀釋至4 mg/ml

　　

　　·17.5 mM和0.1 M乙酸

　　

　　·10x DMEM（Sigma，D2429）

　　

　　·1x DMEM（Sigma，D5796）

　　

　　·培養(yǎng)基補充劑（如L-谷氨酰胺，視細(xì)胞類型而定）

　　

　　·1M超純水中的NaOH

　　

　　·7.5%碳酸氫鈉（Sigma，S8761）

　　

　　·無菌超純水

　　

　　

　　1.2 設(shè)備與耗材

　　

　　·µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片(80376)

　　

　　·ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)(10902)含一套灰色灌注管套裝(10968)

　　

　　·標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（超凈工作臺、細(xì)胞解離試劑盒、培養(yǎng)瓶、移液器、吸頭等）

　　

　　·倒置顯微鏡

　　

　　·冰塊和冷卻架

　　

　　重要提示：為避免產(chǎn)生氣泡，灌注裝置和培養(yǎng)基的脫氣至關(guān)重要。在實驗開始前一天將以下部件放入培養(yǎng)箱中。只要不打開包裝，就能保持無菌狀態(tài)。   

 

　　• 灌注裝置（在包裝內(nèi)）   

　　

　　 • 用于細(xì)胞接種的細(xì)胞培養(yǎng)基（在小容器中加入所需體積的培養(yǎng)基，并稍微松開蓋子）由于氣體在水和塑料中的溶解度與溫度有關(guān)，因此有必要采用這一程序。在較高溫度下，水和塑料吸收的氣體比在較低溫度下少。

　　

　　2、制備含球狀體的3D凝膠

　　

　　在無菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。

　　

　　重要提示：此共培養(yǎng)實驗的下一步需要先前生成的球狀體。用于生成球狀體的一些ibidi解決方案有µ-Slide Spheroid Perfusion(ibidi, 80350)。如需了解生成細(xì)胞球狀體的詳細(xì)步驟，請參閱ibidi Labware Application Note 63：Generation and Dynamic Culture of L929 Spheroids in the µ-Slide Spheroid Perfusion，或Bioinert ULA超低吸附表面系列產(chǎn)品(ibidi 81150, 80800 and 80420)

　　

　　1.用5µg/cm I型膠原蛋白（牛尾或大鼠尾，取決于所需的凝膠）預(yù)涂培養(yǎng)孔。涂上18µl 0.07µg/µl I型膠原蛋白溶液，在室溫下孵育1小時。培養(yǎng)時間結(jié)束后，用PBS輕輕清洗。

　　

　　注意：此步驟對于防止3D凝膠脫落至關(guān)重要。因此，重要的是用H2O或PBS將I型膠原稀釋至0.07µg/µl的最終濃度。

　　

　　2.取出先前生成的球狀體（例如，根據(jù)說明書使用µ-Slide Spheroid Perfusion球體灌注通道載玻片）并在室溫下將其收集到層流罩下的試管中。

　　

　　3.如果凝膠基質(zhì)中需要補充劑，可將其添加到1x細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將其置于層流罩中的冰塊上。

　　

　　4.將所有其他成分和一個容量足以容納凝膠總量的無菌試管放在層流罩的冰上。拆開載玻片的包裝，將其也放入層流罩中。

　　

　　5.用移液管將除膠原蛋白和細(xì)胞懸浮液外的所有成分按表1和表2所列順序移入試管中，并將其置于冰上。通過上下移液混合，然后放回冰上。

　　

　　移取膠原凝膠的重要注意事項

　　

　　移取凝膠時一定要使用預(yù)冷移液器吸頭（4°C）。

　　

　　制備膠原蛋白I凝膠基質(zhì)時，由于粘度較高，建議所有步驟都采用反向移液。將移液器按壓至第二個壓力點，將凝膠注入整個移液器吸頭。僅在達(dá)到第一個壓力點之前分配凝膠。這樣移液器吸頭中會有殘留的凝膠需要丟棄，但體積會更加精確。另外，您也可以使用專為高粘度溶液設(shè)計的移液器。我們推薦使用EppendorfVisco吸頭或Gilson Microman E吸頭。

　　

　　注意：即使在4°C溫度下，凝膠混合物也最多可使用5分鐘，然后會出現(xiàn)部分凝膠化。

　　

　　6.確保I型膠原蛋白,鼠尾膠原蛋白在17.5 mM乙酸中稀釋至4.0 mg/ml，牛尾膠原蛋白在0.1 M乙酸中稀釋至4.0 mg/ml。請查看分析證書 (CoA)，以了解特定批次的膠原蛋白濃度。

　　

　　注意：在稀釋膠原蛋白之前，必須用移液管上下移動幾次，使其充分混合，以形成均勻的溶液。

　　

　　7.將膠原蛋白加入步驟5中制備的混合物中。用移液管充分混合，同時始終將試管置于冰上。

　　

　　8.將制備好的球體懸液加入混合物中。盡量在50µl的體積內(nèi)收集盡可能多的球形體。然后，短暫渦旋混合樣品。

　　

　　9.現(xiàn)在可以將混合物移入µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片。移液過程中，請將載玻片片放在冰上。

　　

　　提示：為避免因冰而劃傷，請將µ-Side放入培養(yǎng)皿中，然后將帶有玻片的培養(yǎng)皿放在冰上。

　　

　　10.取下載玻片上側(cè)的保護(hù)膜，在每個孔中注入30 µl液體凝膠。避免產(chǎn)生氣泡。

　　

　　

　　使用µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流載玻片灌注的實驗流程示意圖

　　

　　11.然后，將蓋玻片放在載玻片的粘性部分。按壓蓋玻片以確保粘合區(qū)域密封嚴(yán)實。

　　

　　12.用隨附的蓋子蓋住Luer魯爾接頭以保持無菌，然后將裝有凝膠的載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5% CO² ）中培養(yǎng)45分鐘，使其凝膠化。

　　

　　13.凝膠化后，用10倍物鏡進(jìn)行相差顯微鏡觀察，可以看到膠原纖維。

　　

　　

　　表 1：使用I型膠原蛋白、鼠尾和 DMEM 制作凝膠的移液方案。所有成分均按移液順序排列。

　　

　　

　　表 2：使用牛膠原I和DMEM制備凝膠的移液方案。所有成分均按移液順序排列。

　　

　　3、內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞接種

　　

　　在無菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。

　　

　　1.在開始使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)開始灌注前,請在37°C的培養(yǎng)箱中預(yù)熱Perfusion Set灌流裝置和內(nèi)皮生長培養(yǎng)基（ECGM  和 ECGM 2）。

　　

　　2.用Accutase處理HUVEC 1-2分鐘，使其脫離。

　　

　　3.收集細(xì)胞懸浮液，然后離心并用少量培養(yǎng)基（ECGM）稀釋，以便計數(shù)。

　　

　　4.計數(shù)細(xì)胞，并將其調(diào)整到培養(yǎng)基中2×106 cells/ml的最終濃度。

　　

　　5.在每個通道中加入約70 µl細(xì)胞懸液。從魯爾接頭中取出剩余的細(xì)胞懸液，重復(fù)接種步驟以提高細(xì)胞均勻度。

　　

　　6.用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭從魯爾適配器中移除剩余的細(xì)胞懸液，并用提供的蓋子蓋住載玻片以保持無菌。

　　

　　7.將載玻片連同無菌濕巾放入培養(yǎng)皿中，然后其放入（37°C, 5% CO²）細(xì)胞培養(yǎng)箱中。8.在靜態(tài)培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)基必須每2-3天更換一次。

　　

　　4、連接ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌注

　　

　　重要提示: 內(nèi)皮生長培養(yǎng)基2含有誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和發(fā)芽的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子。

　　

　　1.在細(xì)胞培養(yǎng)期間，按ibidi Pump System中的說明準(zhǔn)備ibidi Pump System。將ECGM2培養(yǎng)基注入儲液池。

　　

　　2.孵育2小時后，將載玻片連接到灌注系統(tǒng)，并注入ECGM2培養(yǎng)基。

　　

　　3.如需進(jìn)行延時系列成像，將載玻片放入顯微鏡載物載物臺的孵育箱（如ibidi Stage Top Incubator加熱孵育系統(tǒng)/臺式培養(yǎng)箱)并開始延時成像。如需單幀成像，請?zhí)崆霸O(shè)置好顯微鏡參數(shù)，以盡可能縮短成像時間。不成像時，將載玻片放回培養(yǎng)箱。若要進(jìn)行終點分析，請在實驗結(jié)束時固定細(xì)胞，然后繼續(xù)染色（見本文「染色」章節(jié))或執(zhí)行下游方案。

　　

　　

　　灌注培養(yǎng)條件下的延時成像實驗裝置示意圖

　　

　　5、活細(xì)胞相差成像示例

　　

　　

　　灌注條件下共培養(yǎng)5天的相差圖像，顯示聚焦的球狀體（左）和聚焦的HUVEC細(xì)胞（右）（I 型膠原鼠尾凝膠）

　　

　　

　　灌注條件下共培養(yǎng)5天的相差圖像，顯示聚焦的球狀體（左）和聚焦的HUVEC細(xì)胞（右）（I 型牛膠原凝膠）

　　

　　6、染色

　　

　　6.1 材料

　　

　　•PBS (14190144, Gibco)

　　

　　•10%福爾馬林，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

　　

　　•Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體，MA5-18135 Invitrogen）

　　

　　•Phalloidin-iFluor 647試劑（ab176758，Abcam ）

　　

　　•4′,6-diamidino-2-phenyl-indole （DAPI）（D9542 Sigma Aldrich）

　　

　　•Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）

　　

　　•破膜緩沖液（0.5% Triton X-100 加入 PBS）

　　

　　•封閉緩沖液（1% BSA + 0.2% Triton X-100 in PBS）

　　

　　•抗體稀釋緩沖液（PBS 中含 1% BSA + 0.05% Triton X-100）

　　

　　•牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G，Sigma Aldrich）

　　

　　6.2 染色步驟

　　

　　1.為實驗制備充足的破膜緩沖液和封閉緩沖液。

　　

　　2.斷開載玻片與泵之間的連接。

　　

　　3.從Luer魯爾接頭處吸出細(xì)胞培養(yǎng)液。

　　

　　4.在一個Luer魯爾接扣注入100 µl PBS，輕輕清洗細(xì)胞兩次，直到看到液體從另一個魯爾接口流出。

　　

　　5.用福爾馬林（10%）代替PBS固定細(xì)胞。首先，從 Luer 端口移除PBS，然后在一個Luer端口加入100 µl福爾馬林，再從另一個Luer端口移除。然后，再次加入100 µl福爾馬林并孵育15分鐘。

　　

　　6.去除福爾馬林，用100 µl PBS沖洗細(xì)胞四次。

　　

　　7.在100 µl破膜緩沖液中孵育細(xì)胞10分鐘（用破膜緩沖液交換PBS，類似于步驟 5--福爾馬林交換）。

　　

　　8.去除破膜緩沖液，用100 µl PBS沖洗細(xì)胞兩次。

　　

　　9.用100 µl封閉緩沖液（像使用福爾馬林一樣將PBS與封閉緩沖液交換）封閉30分鐘。

　　

　　10.在封閉緩沖液步驟中，準(zhǔn)備足夠的抗體稀釋緩沖液來稀釋一抗和二抗。

　　

　　11.用抗體稀釋緩沖液稀釋標(biāo)記抗體（或一抗）（1:100 稀釋度）。

　　

　　12.用100 µl一抗溶液置換封閉緩沖液，然后在4°C孵育細(xì)胞過夜。

　　

　　13.從這時起，樣品應(yīng)盡可能保存在黑暗中。

　　

　　14.用100 µl封閉緩沖液清洗三次。

　　

　　15.用相同的抗體稀釋緩沖液稀釋（第二抗體和）類熒光素及DAPI（類熒光素 647 結(jié)合物 1:1000 稀釋，DAPI 10 µg/ml）。

　　

　　16.用100 µl的二次染色液更換封閉緩沖液，并在黑暗中孵育過夜。

　　

　　17.用100 µl封閉緩沖液清洗三次。

　　

　　18.用PBS更換封閉緩沖液（每個通道100 µl）

　　

　　19.成像前保存在4°C黑暗處。最好立即進(jìn)行成像，因為存放時間過長會降低成像質(zhì)量。

　　

　　7、染色共培養(yǎng)的圖像示例

　　

　　

　　在灌注條件下共培養(yǎng)3天后，對球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動蛋白絲：Phalloidin-iFluor 647（紅色）；CD31（對HUVEC特異性）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色），（I 型膠原大鼠尾部凝膠）。

　　

　　

　　在灌注條件下共培養(yǎng)3天后，對球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動蛋白絲：Phalloidin-iFluor 647（紅色）；CD31（對HUVEC特異性）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色），（I型膠原牛凝膠）。